光学显微镜技术
人眼观察物体的能力是有限的。一般的情况下,在25cm的明视距离内,人眼只能分辨相距0.1~0.2mm的两个物体。也就是说,当两个物体相距不到0.1mm的时候,人眼就会把它们看成是一个物体了。这个极限便称为人眼的分辨本领。从远古时代,人们就渴望看到更多肉眼看不到的事物。在光学显微镜它发明出来之前,人类关于周围世界的观念局限在用肉眼,或者靠手持透镜帮助肉眼所看到的东西。
光学显微镜(optical microscope)是利用光学原理,用可见光作为光源,把人眼所不能分辨的微小物体放大成像,以供人们提取微细结构信息的光学仪器。光学显微镜主要利用两个凸透镜恰当的调节组合,经物镜形成倒立实像,经目镜进一步放大成像,对标本进行放大观察。显微镜是人类各个时期最伟大的发明物之一。
早在公元前一世纪,人们发明了玻璃,罗马人透过它观察事物和做各种测试。大约在公元4世纪,罗马人终于挖掘了玻璃除了观赏之外的其他功能:他们开始用玻璃来制造门窗、杯子等实用的东西。与此同时,我国则出现了利用水晶石打磨透镜的技术,不过这通常只是作为饰物使用。13世纪,马可波罗将这种水晶透镜带回欧洲,欧洲人因此学会了磨制镜片的方法。人们用各种形状的透明玻璃来做实验,其中就有边缘薄、中间厚的玻璃(凸透镜)。人们很快发现,凸透镜可以产生物体的放大影像。当时戴眼镜的多数是些年纪很大的富翁,他们需要的是老花镜,也就是凸透镜。人们很快发现,凸透镜可以令物体的影像放大。凸透镜因其具有放大功能而被叫做放大镜。 一些人开始使用凸透镜来观察细小的物体,凸透镜在科学研究中开始发挥它巨大的作用。于是,一些极具好奇心的人开始使用凸透镜来观察细小的物体,显微镜就是在这个时候诞生的。
显微镜有两种形式,一种是只有一个透镜(凸透镜)的显微镜,称为单式显微镜;另一种是则是用用二块或多块凸透镜组合而成的显微镜,称为复式显微镜。单式显微镜有一个致命的缺点,那就是它的焦距与透镜直径成正比,而焦距又与放大倍数成反比。也就是说,焦距越短,放大倍数越大,而透镜直径又越小。如果放大倍数是100倍,透镜的焦距为0.25毫米,透镜直径大约为0.33毫米。这个比大头针头还小的透镜在当时根本制造不出来。因此,当时的凸透镜的放大倍数最大不过25倍。这种放大倍数是玩具级别的,只能让小孩观察小虫,想要观察更细微的东西,只能寻求别的工具。因此,为了观察更多的细微物体,人们迫切需要一种更好的放大工具。为了提高单镜片显微镜的能力,必须要缩短焦距。 然而,缩短焦距必须要缩短镜片直径,经过一段时间之后,镜片将变得很难看清。为了解决这个问题,17世纪左右,人们发明了复式显微镜。
16 世纪末期,荷兰的著名磨镜师詹森和他父亲汉斯发明了第一个简陋的复式显微镜【图1】。1590年,詹森无意中把两片凸玻璃片装到一个金属管子里,并用这个管子去看街道上的建筑物,意外发现教堂高塔上大公鸡的雕塑比原来大了好几倍。詹森父子俩抓住这个偶然的发现,认真思索,反复实践,用大大小小的凸玻璃片做各种距离不等的配合终于发明了世界上第一台复式显微镜。詹森成为了世界上第一个将多块凸透镜组合在一起的人,就是这一举动,为人类打开了微观世界的大门。父亲汉斯帮助他制作出了世界上第一台复式显微镜。
这个显微镜是由三个镜筒连接而成,看上去像是一根手电筒。显微镜中间的镜筒较粗,是手握的地方,另外两个镜筒分别插入它的两端,可以自由伸缩,从而达到聚焦的目的。镜头有两个,都是凸透镜,分别固定在镜筒的两端。物镜是一个只有一个凸面的单凸透镜,目镜是一个有两个凸面的双凸透镜。当这个显微镜的两个活动镜筒完全收拢时,它的放大倍数是3倍;当两个活动镜筒完全伸出时,它的放大倍数是10倍(其实这也是最早的变焦镜头)。
图1 詹森发明的复式显微镜
复式显微镜里,紧贴着物体的镜片叫做“物镜”,紧贴着眼睛的就叫做“目镜”。复式显微镜在性能上明显优于单式显微镜。一是它的放大率可以做得很高,可以把几个放大倍数较小的凸透镜组合起来获得很高的放大率。二是制造工艺较简单,不必磨制一个个极小的透镜。复式显微镜的发明,是科学史上的里程碑,人类从此开始认识微观世界。
1610年前后,意大利的伽利略和德国的开普勒在研究望远镜的同时,改变物镜和目镜之间的距离,得出了光学显微镜的光路结构,当时的光学工匠遂纷纷从事光学显微镜的制造、推广和改进。
17世纪中叶,英国的胡克和荷兰的列文胡克,都对光学显微镜的发展作出了卓越的贡献。世界上第一台真正意义上的显微镜的发明者是荷兰的布匹商人列文虎克。荷兰生物学家列文胡克年轻时在一家杂货店当学徒,经常磨制镜片玩,并用他自己磨制出了简易的显微镜,只有一个镜片,可以用手拿着进行观察。后来,他自己学会了精磨透镜技术,后来他用两块精磨的镜片制成了世界上最早可以放大300倍的金属结构的显微镜,使人类看到了过去从未看到的微生物世界。他第一次描述了许多肉眼所看不见的微小植物和动物。
1665年前后,胡克在光学显微镜中加入粗动和微动调焦机构、照明系统和承载标本片的工作台。这些部件经过不断改进,成为现代光学显微镜的基本组成部分。“细胞”名词的由来便由虎克利用复合式显微镜观察植物的木栓组织上的微小气孔而得来的。
1673~1677年期间,列文胡克制成单组元放大镜式的高倍光学显微镜。他一生亲自磨制了550个透镜,装配了247架显微镜,至今保留下来的有9架。现存于荷兰尤特莱克特大学博物馆中的一架放大倍数为270倍,分辨率为1.4微米。在当时,这个水平是很高的,直到19世纪初所制的显微镜还未超过这一水平。
18~19世纪,复合式显微镜得到了充分的完善,人们发明了能够消除色差和其他光学误差的透镜组,与现在我们使用的普通光学显微镜相仿。光学显微镜已经达到了分辨率的极限。
19世纪,高质量消色差浸液物镜的出现,使光学显微镜观察微细结构的能力大为提高。1827年阿米奇第一个采用了浸液物镜。19世纪70年代,德国人阿贝奠定了光学显微镜成像的古典理论基础。这些都促进了光学显微镜制造和显微观察技术的迅速发展,并为19世纪后半叶包括科赫、巴斯德等在内的生物学家和医学家发现细菌和微生物提供了有力的工具。
自十六世纪末发明以来,光学显微镜加深了我们对基础生物学、生物医学研究、医疗诊断和材料科学的认识。目前,光学显微镜技术已远远超出罗伯特·胡克和列文胡克所发明的第一台显微镜的水平。随着科学技术的发展,显微镜检方法由最传统的明视野显微镜和暗视野显微镜发展出了荧光显微镜、相差显微镜、共聚焦显微镜、偏光显微镜、倒置显微镜、体视显微镜等多种不同种类和用途的光学显微镜。人类研发的这些仪器及相关技术已经使我们可以更加深入地揭示细胞的结构和生化机能。虽然种类很多,但应用最广的仍然是普通光学显微镜,且其基本原理确非常简单,与普通学生用光学显微镜相同【图2】。
图2 光学显微镜
光线在均匀的各向同性介质中,两点之间以直线传播,当通过不同密度介质的透明物体时,则发生折射现象,这是由于光在不同介质的传播速度不同造成的。当与透明物面不垂直的光线由空气射入透明物体(如玻璃)时,光线在其介面改变了方向,并和法线构成折射角(图3)。折射光线与入射光线,法线处在同一平面内,折射光线与入射光线分别位于法线的两侧;入射角的正弦与折射角的正弦成正比。
图3 光的折射示意图
折射率是一个反映介质的光学性质的物理量,是指光在空气中的速度与光在该材料中的速度之比率。当光从真空(或空气)射入某种介质时,入射角大于折射角;当光由介质射入真空(或空气)时,入射角小于折射角。材料的折射率越高,使入射光发生折射的能力越强。
透镜是组成显微镜光学系统的最基本的光学元件,物镜目镜及聚光镜等部件均由单个和多个透镜组成。依其外形的不同,可分为凸透镜(正透镜)和凹透镜(负透镜)两大类。
当一束平行于光轴的光线通过凸透镜后相交于一点,这个点称“焦点”,通过交点并垂直光轴的平面,称“焦平面”。焦点有两个,在物方空间的焦点,称“物方焦点”,该处的焦平面,称“物方焦平面”;反之,在象方空间的焦点,称“象方焦点”,该处的焦平面,称“象方焦平面”。
光线通过凹透镜后,成正立虚像,而凸透镜则成正立实像。实像可在屏幕上显现出来,而虚像不能。
1、当物体位于透镜物方二倍焦距以外时,则在象方二倍焦距以内、焦点以外形成缩小的倒立实象。
2、当物体位于透镜物方二倍焦距上时,则在象方二倍焦距上形成同样大小的倒立实象。
3、当物体位于透镜物方二倍焦距以内,焦点以外时,则在象方二倍焦距以外形成放大的倒立实象。
4、当物体位于透镜物方焦点上时,则象方不能成象。
5、当物体位于透镜物方焦点以内时,则象方也无象的形成,而在透镜物方的同侧比物体远的位置形成放大的直立虚象。
光学显微镜的成像原理是指其几何成象原理。光学显微镜和放大镜起着同样的作用。放大镜和显微镜是用于观测放置在观测人员近处应予放大的物体的,就是把近处的微小物体成一放大的像,以供人眼观察。只是光学显微镜比放大镜可以具有更高的放大率而已。
光学显微镜主要由物镜和目镜组成,每组镜片相当于一个凸透镜。物镜的焦距很短,目镜的焦距较长。无论是构造简单的学生显微镜还是复杂精密的研究用显微镜,其工作的基本原理是物体先经过物镜成放大的实像,再经目镜成放大的虚像,二次放大,便能看清楚微小的物体。也就是说,显微镜成像实质是一个二步成像的过程,第一步成像由物镜完成,第二步成像由目镜完成(图4)。
图4 显微镜两次成像示意图
图5所示为光学显微镜成像的原理图。图中把物镜和目镜均以单块透镜表示。物体AB位于物镜前方,离开物镜的距离大于物镜的焦距,但小于两倍物镜焦距。所以,它经物镜以后,必然形成一个倒立的放大的实像A1B1。A1B1位于目镜的物方焦点F2或者在很靠近F2的位置上。再经目镜放大为虚像A2B2后供眼睛观察。目镜的作用与放大镜一样。所不同的只是眼睛通过目镜所看到的不是物体本身,而是物体被物镜所成的已经放大了一次的像。
图5 光学显微镜成像原理图
在镜检时,人们总是希望能清晰而明亮的理想图象,这就需要显微镜的各项光学技术参数达到一定的标准,并且要求在使用时,必须根据镜检的目的和实际情况来协调各参数的关系。只有这样,才能充分发挥显微镜应有的性能,得到满意的镜检效果。
显微镜的光学技术参数包括:光源、数值孔径、分辨率、放大率、焦深、视场宽度、覆盖差、工作距离等等。这些参数并不都是越高越好,它们之间是相互联系又相互制约的,在使用时,应根据镜检的目的和实际情况来协调参数间的关系,但应以保证分辨率为准。
光源是指能发射光波的物体。可见光频率范围:3.9×1014~7.5×1014Hz。真空中对应的波长范围:390nm~760nm。相应光色有紫、蓝、青、绿、黄、橙、红。
显微镜的照明可以用天然光源或人工光源。
1、天然光源:光线来自天空,最好是由白云反射来的。不可利用直接照来的太阳光。
2、人工光源:常用的人工光源有显微镜灯;日光灯;对人工光源的基本要求是有足够的发光强度;光源发热不能过多。
孔径角又称“镜口角”,为物镜光轴上的物体点与物镜前透镜的有效直径所形成的角度,是由标本上一点发出的进入物镜最边缘光线L和进入物镜中心光线OA之间的夹角。孔径角越大,进入物镜的光通亮就越大,它与物镜的有效直径成正比,与焦点的距离成反比。
数值孔径也叫镜口率,简写NA 或A,是物镜和聚光器的主要参数,是判断两者(尤其对物镜而言)性能高低的重要标志。数值孔径与显微镜的分辨力成正比。干燥物镜的数值孔径为0.05-0.95,油浸物镜(香柏油)的数值孔径为1.25。数值孔径的大小,分别标刻在物镜和聚光镜的外壳上。
数值孔径(NA)是物镜前透镜与被检物体之间介质的折射率(n)和孔径角(u)半数的正弦之乘积。显微镜观察时,若想增大NA值,孔径角是无法增大的,唯一的办法是增大介质的折射率n值。基于这一原理,就产生了水浸物镜和油浸物镜,因介质的折射率n值大于1,NA值就能大于1。
数值孔径最大值为1.4,这个数值在理论上和技术上都达到了极限。目前,有用折射率高的溴萘作介质,溴萘的折射率为1.66,所以NA值可大于1.4。
这里必须指出,为了充分发挥物镜数值孔径的作用,在观察时,聚光镜的NA值应等于或略大于物镜的NA值。
数值孔径与其他技术参数有着密切的关系,它几乎决定和影响着其他各项技术参数。它与分辨率成正比,与放大率成正比,与焦深成反比,NA值增大,视场宽度与工作距离都会相应地变小。
物镜的作用是将标本作第一次放大,它是决定显微镜性能的最重要的部件—分辨力的高低。分辨力也叫分辨率或分辨本领。分辨力的大小是用分辨距离(所能分辨开的两个物点间的最小距离)的数值来表示的。在明视距离(25cm)之处,正常人眼所能看清相距0.073mm的两个物点,这个0.073mm的数值,即为正常人眼的分辨距离。显微镜的分辨距离越小,即表示它的分辨力越高,也就是表示它的性能越好。显微镜的分辨力的大小由物镜的分辨力来决定的,而物镜的分辨力又是由它的数值孔径和照明光线的波长决定的。要提高分辨率就要用波长更短的照明光,及增大物镜的数值孔径。显微镜的放大倍数越高,分辨率越高。这是因为,放大倍数越高,其像的细节看得越清晰,即分辨率也就越高了。
要知道的几个重要的分辨力:人眼的分辨力为0.2mm/250mm;光学显微镜的分辨力为0.2um;电子显微镜的分辨力为0.2nm。
在显微镜下所看到的物像和实际物体之间的大小比例叫显微镜的放大率或放大倍数。显微镜的总放大倍数等于物镜和目镜放大倍数的乘积,即:放大倍数=目镜倍数×物镜倍数。通常用×表示。放大倍数指的是长度的比值而不是面积的比值。例:放大倍数为100×,指的是长度是1μm的标本,放大后像的长度是100μm,要是以面积计算,则放大了10000倍。显微镜下物像的放大主要由物镜、镜筒长度、目镜所决定。由于经过物镜和目镜的两次放大,所以显微镜总的放大率Γ应该是物镜放大率β和目镜放大率Γ1的乘积:Γ=βΓ1。
放大率也是显微镜的重要参数,但也不能盲目相信放大率越高越好。显微镜放大倍率的极限即有效放大倍率。当选用的物镜数值孔径不够大,即分辨率不够高时,显微镜不能分清物体的微细结构,此时即使过度地增大放大倍率,得到的也只能是一个轮廓虽大但细节不清的图像,称为无效放大倍率。反之如果分辨率已满足要求而放大倍率不足,则显微镜虽已具备分辨的能力,但因图像太小而仍然不能被人眼清晰视见。所以为了充分发挥显微镜的分辨能力,应使数值孔径与显微镜总放大倍率合理匹配。适合的放大倍数决定于物镜的数值孔径,一船应为数值孔径的500~1000倍。
分辨率和放大率是两个不同的但又互有联系的概念,其关系式为500NA<Γ<1000NA。
焦点深度简称为焦深,是指在使用显微镜时,当焦点对准某一物体时,不仅位于该点平面上的各点都可以看清楚,而且在此平面的上下一定厚度内,也能看得清楚,这个清楚部分的厚度就是焦深。也就是说,在显微镜的光轴上有一段距离范围内物体被看得清晰,超出这段距离的物体就模糊不清,这段距离的上下限叫焦点深度。
焦深大,可以看到被检物体的全层,而焦深小,则只能看到被检物体的一薄层,焦深与其他技术参数有以下关系:(1)焦深与总放大倍数及物镜的数值孔径成反比。(2)焦深大,分辨率降低。
观察显微镜时,所看到的明亮的圆形范围叫视场或视野,即目镜中观察到的物像的一定范围。它的大小是由目镜里的视场光阑决定的。视场光阑的直径叫目镜的视场数值.
视场直径也称视场宽度,是指在显微镜下看到的圆形视场内所能容纳被检物体的实际范围。视场直径愈大,愈便于观察。
有公式 F=FN/β。式中F为视场直径,FN为视场数(Field Number, 简写为FN,标刻在目镜的镜筒外侧),β为物镜放大率。由公式可看出:(1)视场直径与视场数成正比。(2) 增大物镜的倍数,则视场直径减小。
显微镜的总放大率小的时候所能看到的标本的范围大,而总放大率愈大所能看到的标本的局部愈小。所以说视野与显微镜的总放大率成反比。因此,若在低倍镜下可以看到被检物体的全貌,而换成高倍物镜,就只能看到被检物体的很小一部份。
工作距离是指当所观察的标本最清楚时物镜的前端透镜下面到标本的盖玻片上面的距离。物镜的工作距离与物镜的焦距有关,物镜的焦距越长,放大倍数越低,其工作距离越长。例:10倍物镜上标有10/0.25和160/0.17,其中10为物镜的放大倍数;0.25为数值孔径;160为镜筒长度(单位mm);0.17为盖玻片的标准厚度(单位 mm)。10倍物镜有效工作距离为6.5mm,40倍物镜有效工作距离为0.48mm 。
镜检时,被检物体应处在物镜的一倍至二倍焦距之间。因此,它与焦距是两个概念,平时习惯所说的调焦,实际上是调节工作距离。
在物镜数值孔径一定的情况下,工作距离短孔径角则大。数值孔径大的高倍物镜,其工作距离小。
显微镜的光学系统也包括盖玻片在内。由于盖玻片的厚度不标准,光线从盖玻片进入空气产生折射后的光路发生了改变,从而产生了相差,这就是覆盖差。覆盖差的产生影响了显微镜的成响质量。
国际上规定,盖玻片的标准厚度为0.17mm,许可范围在0.16-0.18mm,在物镜的制造上已将此厚度范围的相差计算在内。物镜外壳上标的0.17,即表明该物镜所要求的盖玻片的厚度。
显微镜构造很复杂,种类很多,但基本结构是由机械和光学两大部分构成(图6)。
图6 光学显微镜的构造
显微镜的光学系统主要包括物镜、目镜、反光镜和聚光器四个部件。广义的说也包括照明光源、滤光器、盖玻片和载玻片等。
物镜(objective)物镜是显微镜最重要的光学部件,利用光线使被检物体第一次成象,是光学显微镜成像系统中决定其分辨率或叫分辨本领的最关键部件,因而直接关系和影响成象的质量和各项光学技术参数,是衡量一台显微镜质量的首要标准。物镜的作用是将标本第一次放大成倒立的实像。物镜由数组透镜组成,安装在物镜转换器上,接近被观察的物体,故叫做物镜或接物镜。
1、物镜的基本类型
(1)按显微镜镜筒长度(以mm计):透射光用160镜筒,带0.17mm厚或更厚的盖玻片;反射光用190镜筒,不带盖玻片;透射光与反射光用镜筒,筒长无限大。
(2)根据使用条件:干燥物镜(非浸式)、浸液物镜(浸式)。其中浸液物镜又可分为,有油浸、水浸、甘油浸及其它浸法(常用放大倍数为90—100倍)。
(3)按光学装置:透射式、反射式以及折反射式。
(4)按数值孔径和放大倍数:低倍(NA≤0.2与β≤10×),中倍(NA≤0.65与β≤40×),高倍(NA>0.65与β>40×)。
(5)按校正象差的情况不同,通常分为消色差物镜,半复消色差物镜,复消色差物镜,平视场消色差物镜,平视场复消色差物镜和单色物镜。
①消色差物镜
消色差物镜(Achromatic objective)是应用最广泛的一类显微物镜,外壳上常有"Ach"字样。这类物镜仅能校正轴上点的位置色差(红,蓝二色)和球差(黄绿光)以及消除近轴点慧差。不能校正其它色光的色差和球差,且场曲很大。
数值孔径为0.1~0.15的低倍消色差物镜一般由两片透镜胶合在一起的双胶物镜构成。数值孔径至0.2的消色差物镜由两组双胶透镜构成。当数值孔径增大到0.3时,再加入一平凸透镜,该平凸透镜决定着物镜的焦距,而其它透镜则补偿由其平面与球面产生的象差。高倍物镜的平面象差可用浸法消除。高倍消色差物镜一般均为浸式,由四部分构成:前片透镜、新月形透镜及两个双胶透镜组。
②复消色差物镜
复消色差物镜(Apochromatic objective)的结构复杂,透镜采用了特种玻璃或萤石等材料制作而成,物镜的外壳上标有“Apo”字样,这种物镜不仅能校正红绿蓝三色光的色差,同时能校正红,蓝二色光的球差。由于对各种像差的校正极为完善,比响应倍率的消色差物镜有更大的数值孔径,这样不仅分辨率高,像质量优而且也有更高的有效放大率。因此,复消色差物镜的性能很高,适用于高级研究镜检和显微照相。
③半复消色差物镜
半复消色差物镜(Semi apochromatic objective)又称氟石物镜,物镜的外壳上标有“FL”字样。在结构上透镜的数目比消色差物镜多,比复消色差物镜少,成象质量上,远较消色差物镜为好,接近于复消色差物镜。
④平视场物镜
平场物镜(Plan objective)是在物镜的透镜系统中增加一快半月形的厚透镜,以达到校正场曲的缺陷,提高视场边缘成像质量的目的。平场物镜的视场平坦,更适用于镜检和显微照相。对于平视场消色差物镜,其倍率色差不大,不必用特殊目镜补偿。而平视场复消色差物镜,则必须用目镜来补偿它的倍率色差。
⑤单色物镜
这类物镜由石英、荧石或氟化锂制的一组单片透镜构成。只能在紫外线光谱区的个别区内使用(宽度不超过20mm),可见光谱区不能采用单色物镜。这类物镜均制成反射式与折反射式系统。主要缺点是相当大一部分光束在中心被遮蔽(入瞳面积的25%)。在新型折反射系统中,由于采用半透明反射镜以及物镜的胶合结构,使这一缺点大为减轻,从而可以取消反射镜框的遮光。并且两同轴反射镜的残余象差是互相补偿的,同时用透镜组来增大数值孔径。若系统的校正满意,孔径达到NA=1.4时,中心遮蔽可不超过入瞳面积的4%。
物镜是显微镜中对成象质量优劣起决定性作用的光学元件。常用的有:①能对两种颜色的光线校正色差的消色差物镜;②质量更高的能对三种色光校正色差的复消色差物镜;③能保证物镜的整个像面为平面以提高视场边缘成像质量的平像场物镜。为了提高显微观察的分辨率,在高倍物镜中采用浸液物镜,即在物镜的下表面和标本片的上表面之间填充折射率为1.5左右的液体。
2、物镜的主要参数
物镜主要参数包括:放大倍数、数值孔径和工作距离等,这些参数,大多刻在物镜筒上(图7)。
图7 物镜的主要参数标识
①消色差物镜
物镜按消色差程度分三类:消色差物镜没有符号,复消色差物镜外壳上刻有“Apo”或“Apochromatic”字样,半复消色差物镜(即萤石物镜)刻有“Fl”、“Neofluar”或“Fluorite”字样,平场物镜上刻有“Planachromate(平场消色差)”,“Planapochromate(平场复消色差)”,“Plan(平场)”,“PL (广视野平场)”,“Epiplan (反射光专用平场)”等字样。
②观察时介质符号
干燥物镜无符号,水浸物镜刻有“W”或“Water”字样,油浸物镜刻有“Oil”,“Oel”,“HI”,“imm”等字样,水浸油浸两用物镜则刻有“W+Oil”;二碘甲烷浸刻有“Meth-iodide”或“Methyleniodide”,甘油浸刻有“Glyz”或“Glyc”等。
③放大倍数
用符号“×”表示,如10×即10倍。一般都省去×号仅刻上数字。有少数工厂刻焦距,以F或mm代表,如F5.2或5.2mm都表示焦距5.2毫米。也有以吋为焦距单位,如1/12表示焦距1/12吋。
④数值孔径
在文献中常用“A”、“N.A”或“n.A”代表,而在物镜外壳上一般直接用数字表示。例如“10/0.25”,表示放大倍数10倍,数值孔径0.25。
⑤标准机械筒长
用数字表示,如160表示机械筒长160mm,“∞”表示筒长无限大。
⑥标准盖玻片厚度
用数字表示,对于透射光用物镜一般都是0.17mm,仅热台用物镜为1.5或1.8mm。对于反射光用物镜为零或不写。如“160/0.17”,表示机械筒长160mm,盖玻片厚度0.17mm。“160/-”表示机械筒长160mm,盖玻片有无皆可。反射光物镜则为“215/0”,“∞/0”,“∞/-”,表示机械筒长215mm或无限大,盖玻片厚度为零或有无皆可。
⑦物镜应变状态
一般用“POL”表示物镜无应变,也有用“P”表示完全无应变,“(P)”表示基本无应变,但可能有少量残存。凡没有上述符号的物镜,一般都有应变,除特殊物镜(如热台用)外,不适合在偏光显微镜中使用。
目镜安装在镜筒的上端,因为它靠近观察者的眼睛,因此也叫接目镜。
1、目镜的结构
通常目镜由上下两组透镜组成,上面的透镜叫做接目透镜,下面的透镜叫做会聚透镜或场镜。上下透镜之间或场镜下面装有一个光阑(它的大小决定了视场的大小),因为标本正好在光阑面上成像,可在这个光阑上粘一小段毛发作为指针,用来指示某个特点的目标。也可在其上面放置目镜测微尺,用来测量所观察标本的大小。
目镜的长度越短,放大倍数越大(因目镜的放大倍数与目镜的焦距成反比)。
2、目镜的作用
目镜的作用是将已被物镜放大的,分辨清晰的实像进一步放大,达到人眼能容易分辨清楚的程度,实质上目镜就是一个放大镜。常用目镜的放大倍数为5~16倍。显微镜的分辨率能力是由物镜的数值孔径所决定的,而目镜只是起放大作用。对于物镜不能分辨出的结构,目镜放的再大,也仍然不能分辨出。显微镜的放大倍数,可粗略视为目镜放大倍数与物镜放大倍数的乘积。
3、目镜与物镜的关系
物镜已经分辨清楚的细微结构,假如没有经过目镜的再放大,达不到人眼所能分辨的大小,那就看不清楚;但物镜所不能分辨的细微结构,虽然经过高倍目镜的再放大,也还是看不清楚,所以目镜只能起放大作用,不会提高显微镜的分辨率。有时虽然物镜能分辨开两个靠得很近的物点,但由于这两个物点的像的距离小于眼睛的分辨距离,还是无法看清。所以,目镜和物镜即相互联系,又彼此制约。
聚光器也叫集光器。位于标本下方的聚光器支架上。它主要由聚光镜和可变光阑组成。
1、聚光镜的主要参数
数值孔径(NA)是聚光镜的主要参数,最大数值孔径一般是1.2~1.4,数值孔径有一定的可变范围,通常刻在上方透镜边框上的数字是代表最大的数值孔径,通过调节下部可变光阑的开放程度,可得到此数字以下的各种不同的数值孔径,以适应不同物镜的需要。有的聚光镜由几组透镜组成,最上面的一组透镜可以卸掉或移出光路,使聚光镜的数值孔径变小,以适应低倍物镜观察时的照明。
2、聚光镜的作用
聚光镜的作用相当于凸透镜,起会聚光线的作用,以增强标本的照明。聚光镜装在载物台的下方。一般地把聚光镜的聚光焦点设计在它上端透镜平面上方约1.25mm处。(聚光焦点正在所要观察的标本上,载玻片的厚度为1.1mm左右)。
小型的显微镜往往无聚光镜,在使用数值孔径0.40以上的物镜时,则必须具有聚光镜。聚光镜不仅可以弥补光量的不足和适当改变从光源射来的光的性质,而且将光线聚焦于被检物体上,以得到最好的照明效果。
可变光阑也叫光圈,位于聚光镜的下方,由十几张金属薄片组成,中心部分形成圆孔。其作用是调节光强度和使聚光镜的数值孔径与物镜的数值孔径相适应。可变光阑开得越大,数值孔径越大(观察完毕后,应将光圈调至最大)。在可变光阑下面,还有一个圆形的滤光片托架。
4、聚光镜的类型
聚光镜的的结构有多种,同时根据物镜数值孔径的大小,相应地对聚光镜的要求也不同 。
①阿贝聚光镜
这是由德国光学大学大师恩斯特•阿贝(Ernst Abbe)设计。阿贝聚光镜由两片透镜组成,有较好的聚光能力,但是在物镜数值孔径高于0.60时,则色差,球差就显示出来。因此,多用于普通显微镜上。
②消色差聚光镜
这种聚光镜又名“消球差聚光镜”和“齐明聚光镜”,它由一系列透镜组成,它对色差球差的校正程度很高,能得到理想的图象,是明场镜检中质量最高的一种聚光镜,其NA值达1.4。因此,在高级研究显微镜常配有此种聚光镜。它不适用于4 ×以下的低倍物镜,否则照明光源不能充满整个视场。
③摇出式聚光镜
在使用低倍物镜时(如4×),由于视场大,光源所形成的光锥不能充满真整个视场,造成视场边缘部分黑暗,只中央部分被照亮。要使视场充满照明,就需将聚光镜的上透镜从光路中摇出。
④其它聚光镜
聚光镜除上述明场使用的类型外,还有作特殊用图的聚光镜。如暗视场聚光镜,相衬聚光镜,偏光聚光镜,微分干涉聚光镜等,以上聚光镜分别适用于相应的观察方式。
反光镜是一个可以随意转动的双面镜,直径为50mm,一面为平面,一面为凹面,装在聚光器下面,可以在水平与垂直两个方向上任意旋转。平面镜反射光线的能力较弱,是在光线较强时使用,凹面镜反射光线的能力较强,是在光线较弱时使用。
反光镜的作用其作用是将从任何方向射来的光线经通光孔反射上来,使由光源发出的光线或天然光射向聚光器。当用聚光器时一般用平面镜,不用时用凹面镜;当光线强时用平面镜,弱时用凹面镜。观察完毕后,应将反光镜垂直放置。
在很多情况下,一台设计精良的显微镜并不一定会获得良好的成像质量。其主要原因多半是光源未调校好,使标本不能获得充分的照明所至。显微镜标本最佳的照明状态应该是明亮、无眩光、而且视场照度是均匀的。显微镜的照明方法按其照明光束的形成,可分为“透射式照明”和“落射式照明”两大类。
1、透射式照明
生物显微镜多用来观察透明标本,需要以透射光来照明。因此,透射式照明适用于透明或半透明的被检物体,绝大数生物显微镜属于此类照明法。透射式照明有两种照明方式。
(1)临界照明
临界照明(Critical illumination)是光源经过聚光镜后,成像于物平面上。若忽略光能的损失,则光源像的亮度与光源本身相同,因此,这种方法相当于在物平面上放置光源。显然,在临界照明中,如果光源表面亮度不均匀,或明显地表现出细小的灯丝等结构,那么就要严重影响显微镜观察效果,这是临界照明的缺点。其补救的方法是在光源的前方放置乳白和吸热滤色片,使照明变得较为均匀和避免光源的长时间的照射而损伤被检物体。
用透射光照明时,物镜成像光束的孔径角,被聚光镜像方光束的孔径角所决定,为使物镜的数值孔径得到充分利用,聚光镜应有与物镜相同或稍大的数值孔径。
(2)柯拉照明
柯拉照明不同于临界照明的地方是它使用了两个聚光镜,从而使照明系统更略显复杂。由于临界照明中物面光照度不均匀的缺点。柯拉照明在光源与聚光镜之间加一辅助聚光镜。可见,由于不是直接把光源成像在被检标本平面上,而是把被光源均匀照明了的辅助聚光镜(也称为柯拉镜)成像在被检标本上,所以物镜的视场(标本)得到均匀的照明。既光源发出光线通过聚光镜后在经过柯拉镜才到达照射平面,其光线均匀而强烈(图8)。这样就消除了临界照明的缺点。
由于柯拉照明可产生均匀明亮,无眩光的标本照明,使显微镜在使用中发挥最大的潜能,现代实验室显微镜的制造商们均推荐采用该项技术。
图8 柯拉照明原理图
2、落射式照明
落射式照明适用于非透明的被检物体,光源来自上方,又称“反射式照明”。在观察不透明物体时,例如通过金相显微镜观察金属磨片,往往是采用从侧面或者从上面加以照明的方式。此时,被观察物体的表面上没有盖玻璃片,标本像的产生是靠进入物镜的反射或散射光线。落射式照明主要应用与金相显微镜或荧光镜检法。
3、暗视场照明
用暗视场方法可以观察超显微质点。所谓超显微质点,是指那些小于显微镜分辨极限的微小质点。暗视场照明的原理是:不使主要的照明光线进入物镜,能够进入物镜成像的只是由微粒所散射的光线。因此,在暗的背景上给出了亮的微粒的像,视场背景虽暗,但衬度(对比)很好,可以使分辨率提高。
安装在光源和聚光器之间。作用是让所选择的某一波段的光线通过,而吸收掉其他的光线,即为了改变光线的光谱成分或削弱光的强度。分为两大类:滤光片和液体滤光器。
盖玻片和载玻片的表面应相当平坦,无气泡,无划痕。最好选用无色,透明度好的,使用前应洗净。盖玻片的标准厚度是0.17±0.02mm,如不用盖玻片或盖玻片厚度不合适,都回影响成像质量。载玻片的标准厚度是1.1±0.04mm,一般可用范围是1~1.2mm,若太厚会影响聚光器效能,太薄则容易破裂。
显微镜的机械装置是显微镜的重要组成部分。其作用是固定与调节光学镜头,固定与移动标本等。主要有镜座、镜臂、载物台、镜筒、物镜转换器、与调焦装置组成。
镜座的作用是支撑整个显微镜,装有反光镜,有的还装有照明光源。镜臂的作用是支撑镜筒和载物台。分固定、可倾斜两种。
载物台又称工作台、镜台,其作用是安放载玻片,形状有圆形和方形两种,其中方形的面积为120mm×110mm。中心有一个通光孔,通光孔后方左右两侧各有一个安装压片夹用的小孔。分为固定式与移动式两种。有的载物台的纵横坐标上都装有游标尺,一般读数为0.1mm,游标尺可用来测定标本的大小,也可用来对被检部分做标记。
镜筒上端放置目镜,下端连接物镜转换器。依据机械筒长是否可以调节可分为固定式和可调节式两种。从目镜管上缘到物镜转换器螺旋口下端的距离称为镜筒长度或机械筒长。机械筒长不能变更的叫做固定式镜筒,而能变更的叫做调节式镜筒,新式显微镜大多采用固定式镜筒,国产显微镜也大多采用固定式镜筒,国产显微镜的机械筒长通常是160mm。
安装目镜的镜筒,有单筒和双筒两种。单筒又可分为直立式和倾斜式两种,双筒则都是倾斜式的。其中双筒显微镜,两眼可同时观察以减轻眼睛的疲劳。双筒之间的距离可以调节,而且其中有一个目镜有屈光度调节(即视力调节)装置,便于两眼视力不同的观察者使用。
物镜转换器固定在镜筒下端,有3~4个物镜螺旋口,物镜应按放大倍数高低顺序排列。旋转物镜转换器时,应用手指捏住旋转碟旋转,不要用手指推动物镜,因时间长容易使光轴歪斜,使成像质量边坏。
显微镜上装有粗准焦螺旋和细准焦螺旋。有的显微镜粗准焦螺旋与装在同一轴上,大螺旋为粗准焦螺旋,小螺旋为细准焦螺旋;有的则分开安置,位于镜臂的上端较大的一对螺旋为是粗准焦螺旋,其转动一周,镜筒上升或下降10mm。 位于粗准焦螺旋下方较小的一对螺旋为细准焦螺旋,其转动一周,镜筒升降值为0.1mm,细准焦螺旋调焦范围不小于1.8mm。
1、按使用目镜的数目可分为双目和单目显微镜(图9,10)。
图9 单目镜显微镜
图10 双目镜显微镜
2、按图像是否有立体感可分为立体视觉和非立体视觉显微镜。
3、按观察对像可分为生物和金相显微镜等。
4、按光学原理可分为偏光、相衬和微差干涉对比显微镜等。
5、按光源类型可分为普通光、荧光、紫外光、红外光和激光显微镜等。
6、按接收器类型可分为目视、摄影和电视显微镜等。
1、生物显微镜
生物显微镜放大倍数一般在40×~2000×之间,光源为透射光。生物显微镜供医疗卫生单位、高等院校、研究所用于微生物、细胞、细菌、组织培养、悬浮体、沉淀物等的观察,同时可以观察其他透明或者半透明物体以及粉末、细小颗粒等物体。
体视显微镜又称“实体显微镜”或“解剖镜”,是一种具有正像立体感的光学显微镜(图11)。体视显微镜放大倍数在7×~45×左右,也可以放大到90×,180×,225×。在生物、医学领域广泛用于切片操作和显微外科手术;在工业中用于微小零件和集成电路的观测、装配、检查等工作。
图11 体视显微镜图片
体视显微镜利用双通道光路,双目镜筒中的左右两光束不是平行,而是具有一定的夹角,即体视角(一般为12度~15度),为左右两眼提供一个具有立体感的图像。它实质上是两个单镜筒显微镜并列放置,两个镜筒的光轴构成相当于人们用双目观察一个物体时所形成的视角,以此形成三维空间的立体视觉图像。
目前体视显微镜的光学结构是由一个共用的初级物镜,对物体成象后的两光束被两组变焦镜分开,并成一体视角再经各自的目镜成象,它的倍率变化是由改变中间镜组之间的距离而获得的,因此又称为“连续变倍体视显微镜”。
荧光显微镜是以紫外线为光源,用以照射被检物体,使之发出荧光,然后在光学显微镜下观察物体的形状及其所在位置(图12)。荧光显微镜用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位等。细胞中有些物质,如叶绿素等,受紫外线照射后可发荧光;另有一些物质本身虽不能发荧光,但如果用荧光染料或荧光抗体染色后,经紫外线照射亦可发荧光,荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。
图12 荧光显微镜图片
相差显微镜又称相衬显微镜,是针对透明样本因光晕而难以被观测到细微结构的问题开发设计。在光学显微镜的发展过程中,相衬镜检术的发明成功,是近代显微镜技术中的重要成就。我们知道,人眼只能区分光波的波长(颜色)和振幅(亮度),对于无色通明的生物标本,当光线通过时,波长和振幅变化不大,在明场观察时很难观察到标本。
相衬显微镜利用被检物体的光程之差进行镜检,也就是有效地利用光的干涉现象,将人眼不可分辨的相位差变为可分辨的振幅差,即使是无色透明的物质也可成为清晰可见(图13)。这大大便利了活体细胞的观察,因此相衬镜检法广泛应用于倒置显微镜中。
图13 相差显微镜图片
倒置显微镜组成和普通光学显微镜一样,只不过物镜与照明系统颠倒,前者在载物台之下,后者在载物台之上,是为了适应生物学、医学等领域中的组织培养、细胞离体培养、浮游生物、环境保护、食品检验等显微观察。由于上述样品特点的限制,被检物体均放置在培养皿(或培养瓶)中,这样就要求倒置显微镜的物镜和聚光镜的工作距离很长,能直接对培养皿中的被检物体进行显微观察和研究。因此,物镜、聚光镜和光源的位置都颠倒过来,故称为“倒置显微镜”。
由于工作距离的限制,倒置显微镜物镜的最大放大率为60×。一般研究用倒置显微镜都配置有4×、10×、20×、及40×相差物镜,因为倒置显微镜多用于无色透明的活体观察。如果用户有特殊需要,也可以选配其它附件,用来完成微分干涉、荧光及简易偏光等观察。
偏光显微镜是用于研究所谓透明与不透明各向异性材料的一种光学显微镜(图14)。偏光显微镜重点在于加入起偏器和检偏器,针对反光或者具有双折射性质的样品,相当于切掉一部分杂光,使产品清晰,如矿石,晶体等。凡具有双折射的物质,在偏光显微镜下就能分辨的清楚,当然这些物质也可用染色法来进行观察,但有些则不可能,而必须利用偏光显微镜。将普通光改变为偏振光进行镜检的方法,以鉴别某一物质是单折射或双折射性因此,偏光显微镜被广泛地应用在矿物、化学等领域,在生物学和植物学也有应用。
图14 偏光显微镜图片
金相显微镜放大倍数在50×~1000×这个范围内,主要应用于金属等多种不透明材料观察,鉴别和分析内部结构组织(图15)。适用于厂矿企业、高等院校及科研等部门。该仪器配用摄像装置,可摄取金相图谱,并对图谱进行测量分析。
图15 金相显微镜图片
金相显微镜是专门用于观察金属和矿物等不透明物体的光学显微镜,这些不透明物体无法在普通的光学显微镜中观察,故金相显微镜主要以反射光为主。在金相显微镜中照明光束从物镜方向射到被观察物体表面,被物面反射后再返回物镜成像。这种反射照明方式也广泛用于集成电路硅片的检测工作。现在的金相显微镜也可以选择带透射光的,方便观察透明状物体和一些粉末状颗粒状样品。
1、 实验时要把显微镜放在座前桌面上稍偏左的位置,镜座应距桌沿 6~7cm左右。
2、打开光源开关,调节光强到合适大小。
3、转动物镜转换器,使低倍镜头正对载物台上的通光孔。先把镜头调节至距载物台1~2cm左右处,然后用左眼注视目镜内,接着调节聚光器的高度,把孔径光阑调至最大,使光线通过聚光器入射到镜筒内,这时视野内呈明亮的状态。
4、将所要观察的玻片放在载物台上,使玻片中被观察的部分位于通光孔的正中央,然后用标本夹夹好载玻片。
5、先用低倍镜观察(物镜10×、目镜10×)。观察之前,先转动粗动调焦手轮,使载物台上升,物镜逐渐接近玻片。需要注意,不能使物镜触及玻片,以防镜头将玻片压碎。然后,左眼注视目镜内,同时右眼不要闭合(要养成睁开双眼用显微镜进行观察的习惯,以便在观察的同时能用右眼看着绘图),并转动粗动调焦手轮,使载物台慢慢下降,不久即可看到玻片中材料的放大物像。
6、如果在视野内看到的物像不符合实验要求(物像偏离视野),可慢慢调节载物台移动手柄。调节时应注意玻片移动的方向与视野中看到的物像移动的方向正好相反。如果物像不甚清晰,可以调节微动调焦手轮,直至物像清晰为止。
7、如果进一步使用高倍物镜观察,应在转换高倍物镜之前,把物像中需要放大观察的部分移至视野中央(将低倍物镜转换成高倍物镜观察时,视野中的物像范围缩小了很多)。一般具有正常功能的显微镜,低倍物镜和高倍物镜基本齐焦,在用低倍物镜观察清晰时,换高倍物镜应可以见到物像,但物像不一定很清晰,可以转动微动调焦手轮进行调节。
8、在转换高倍物镜并且看清物像之后,可以根据需要调节孔径光阑的大小或聚光器的高低,使光线符合要求(一般将低倍物镜换成高倍物镜观察时,视野要稍变暗一些,所以需要调节光线强弱)。
9、观察完毕,应先将物镜镜头从通光孔处移开,然后将孔径光阑调至最大,再将载物台缓缓落下,并检查零件有无损伤(特别要注意检查物镜是否沾水沾油,如沾了水或油要用镜头纸擦净),检查处理完毕后即可装箱。
1、目镜和物镜的使用
一般都是用一个放大倍数适中的目镜(10×)和最低倍的物镜开始观察,逐步改用倍数较高的物镜,从中找到符合实验要求的放大倍数。
转换物镜时,先用低倍镜观察,调节到正确的工作距离(成像最清晰)。如果进一步使用高倍物镜观察,应在转换高倍物镜之前,把物像中需要放大观察的部分移至视野中央(将低倍物镜转换成高倍物镜观察时,视野中的物像范围缩小了很多)。低倍物镜和高倍物镜基本齐焦(同高调焦),在用低倍物镜观察清晰时,换高倍物镜应可以见到物像,但物像不一定很清晰,可以转动细准焦螺旋进行调节。
通常认为,使用任何一个物镜时,有效放大倍数的上限是1,000乘它的数值孔径,下限是250乘它的数值孔径。如40×物镜的数值孔径是0.65,则上、下限分别为:1000×0.65=650倍和250×0.65≈163倍,超过有效放大倍数上限的叫做无效放大,不能提高观察效果。低于下限的放大倍数则人眼无法分辨,不利于观察。一般最实用的放大倍数范围是500—700乘数值孔径之间的数字。
2、油浸物镜的使用
使用油浸物镜时,一般不要使用同高调焦。同高调焦只适用于每台显微镜的原配物镜,在使用低倍和高倍物镜时,是一个极有利的方便条件,但在使用油浸物镜时,则受到一定限制,一般地说,用油镜观察未加盖玻片的标本片(载玻片)时,利用同高调焦的安全度较大,而对于有盖玻片的标本片,要小心使用,因为油浸物镜的工作距离很短,在设计和装配时所考虑的同高是对标准厚度盖玻片的。
用油浸物镜时,只在标本片上滴香柏油。观察完毕后,要及时进行清洁工作,如不及时进行,香柏油粘上灰尘,擦拭时灰尘粒子可能磨损透镜,香柏油在空气中暴露时间长,还会变稠、变干,擦拭很困难,对仪器很不利。擦拭要细心,动作要轻。油浸物镜前端先用干的擦镜纸擦一两次,把大部分油去掉,再用二甲苯滴湿的擦镜纸擦两次,最后再用干的擦镜纸擦一次。标本片上的香柏油可用“拉纸法”(即把一小张擦镜纸盖在香柏油上,然后在纸上滴一些二甲苯,趁湿把纸往外拉,这样连续三四次,即可干净,一般不会损坏未加盖玻片的涂片标本)擦净。擦镜纸也要防尘,一般在使用前,将每页剪成8小块,贮存在一个干净的小培养皿中,用起来既节省又方便。
3、聚光器的使用方法
(1)使用聚光器的原因
当放大倍数增加时,一方面由于放大倍数越高,透镜数目越多,被透镜吸收的光线也越多;另一方面由于视场(指的是所能看到被检标本的范围)的亮度与放大倍数的平方成反比,即放大倍数越高,视场越暗。为了得到足够的亮度,必须安装聚光器,把光线集中到所要观察的标本上。
(2)观察时聚光器应处的高度
观察时,要保证得到最好的观察效果,聚光器的聚光焦点应正好落在标本上。要实现这个条件,就必须调节聚光器的高度。当用平行光照明时,聚光器的聚光焦点是在它上端透镜平面中心上方约1.25mm之处,因此,人们常常要求在观察时将聚光器上升到它上端透镜平面仅稍稍低于载物台平面的高度,这样聚光焦点就可能落到位于标准厚度载玻片上的标本上。当使用比标准厚度薄的载玻片来承放标本时,聚光器的位置要相应地降低一些,而当使用过厚地载玻片时,聚光焦点只能落在标本下方,不利于精细的观察。
(3)聚光器与物镜的配合
这里所谓的配合,就是使聚光器和物镜这两者的数值孔径取得一致,以更好的进行较为精细的观察。假如聚光器的数值孔径低于物镜,那物镜的部分数值孔径就浪费了,从而达不到它的最高分辨力。假如把聚光器的数值孔径大于物镜的数值孔径,则一方面不能提高物镜的规定分辨力,另一方面反会由于照明光束过宽,使物象的清晰度下降。聚光器与物镜配合的操作方法是:在完成照明、调焦操作后,取下目镜直接向镜筒中看,把聚光器下的可变光阑关到最小,再慢慢地开大。开到它的口径与所见视场的直径恰好一样大,然后按上目镜,即可进行观察。每转换一次物镜,都要随着进行依次这样的配合操作。有的聚光器可变光阑的边框上刻有表示开启口径的尺度,可以根据刻度来进行配合。
1、必须熟练掌握并严格执行使用规程。
2、取送显微镜时一定要一手握住弯臂,另一手托住底座。显微镜不能倾斜,以免目镜从镜筒上端滑出。取送显微镜时要轻拿轻放。
3、观察时,不能随便移动显微镜的位置。
4、凡是显微镜的光学部分,只能用特殊的擦镜头纸擦拭,不能乱用他物擦拭,更不能用手指触摸透镜,以免汗液玷污透镜。
5、保持显微镜的干燥、清洁,避免灰尘、水及化学试剂的玷污。
6、转换物镜镜头时,不要搬动物镜镜头,只能转动转换器。
7、切勿随意转动调焦手轮。使用微动调焦旋钮时,用力要轻,转动要慢,转不动时不要硬转。
8、不得任意拆卸显微镜上的零件,严禁随意拆卸物镜镜头,以免损伤转换器螺口,或螺口松动后使低高倍物镜转换时不齐焦。
9、使用高倍物镜时,勿用粗动调焦手轮调节焦距,以免移动距离过大,损伤物镜和玻片。
10、用毕送还前,必须检查物镜镜头上是否沾有水或试剂,如有则要擦拭干净,并且要把载物台擦拭干净,然后将显微镜放人箱内,并注意锁箱。
(谷建平 韩懿岚 赵欢欢)